Sequenciamento por nanoporos

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A tecnologia de sequenciamento por nanoporos

Autor | César Henrique Yokomizo

 

Você conhece a tecnologia de sequenciamento por nanoporos?   

 

Resumidamente, o sequenciamento é realizado através da passagem da amostra por nanoporos proteicos. Agora vamos falar do processo com mais detalhes! 

 

A amostra, geralmente DNA ou RNA, é adicionada a uma parte do equipamento chamada de flow cell, que é composta por uma membrana sintética onde se inserem milhares de proteínas - 2048 por flow cell - formando os nanoporos. O sequenciamento irá ocorrer justamente quando a amostra atravessa os poros proteicos.  

 

A proteína inicialmente utilizada para a formação dos poros foi a alfa-hemolisina, uma toxina da bactéria Staphylococcus aureus, onde atua na formação de poros em células infectadas, evento que pode induzir à morte dessas células. 

 

A membrana, onde ficam inseridas as proteínas, é composta geralmente de nitreto de silício (SiNx) ou óxido de silício (SiO2), e nela aplica-se um campo elétrico que passa através dos nanoporos, gerando uma força eletroforética que induz a passagem de moléculas carregadas através dos poros proteicos.

 

Na passagem, as moléculas causam alterações mensuráveis na corrente iônica. No caso de amostras de DNA ou RNA, ao passar pelos poros, cada nucleotídeo (A,T, C, U ou G) causa uma alteração específica na corrente iônica, permitindo identificar a composição da sequência.

 

Adaptada de Applications of Oxford Nanopore Sequencing in Schizosaccharomyces pombe.

 

A tecnologia de sequenciamento foi desenvolvida pela empresa Oxford Nanopore Technologies®, e oferece uma plataforma com diversas características atrativas: não é  necessário usar sondas de marcação nas amostras, capacidade de analisar sequências longas - com tamanhos de até 2,3 Mb (2,3 x 106 nucleotídeos) - e em grandes quantidades (high throughput). 

 

Os nanoporos são capazes de ler até 400 nucleotídeos por segundo, embora com menor acurácia quando comparamos com tecnologias usadas para leituras de sequências curtas (short reads). 

 

A portabilidade - o modelo MinION mede 14 cm e pesa 450 gramas - aliada ao baixo custo - US$1000 - permitem que vários laboratórios adquiram o equipamento, criando uma autonomia para realizar os sequenciamentos. Além disso, a facilidade de transporte possibilita a realização de sequenciamentos in loco.

 

Uma característica importante da tecnologia é que ela permite o sequenciamento direto do RNA, ou seja, sem a necessidade de realizar a  transcrição reversa do RNA para sintetizar o DNA complementar (cDNA).

 

A proteína que faz a “leitura” da sequência tem duas partes principais, que podemos dividir em motor e leitora. A porção motora tem função mecânica e empurra a sequência até a porção de leitura que fica inserida na membrana, possibilitando a identificação dos nucleotídeos em decorrência das alterações elétricas geradas na passagem das amostras.     

 

A tecnologia foi aperfeiçoada ao longo dos últimos anos, sendo aplicada em diversas situações como a leitura de sequências ultra longas, o que possibilitou romper a limitação de tecnologias anteriores de leitura apenas de sequências curtas. 

 

Além disso, não há necessidade de amplificação da sequência analisada, outro gargalo de tecnologias mais antigas que foi superado.

 

Atualmente, as inovações têm caminhado no sentido de expandir o uso da tecnologia de nanoporos para além dos limites do sequenciamento de DNA, com grandes esforços para aplicação da tecnologia em screening biológico visando a identificação de organismos. 

 

A tecnologia pode ser utilizada também na área de diagnósticos clínicos e para o sequenciamento de proteínas, aplicação que apresenta os maiores desafios técnicos. 

 

As aplicações em diferentes áreas são possíveis principalmente por conta da utilização de membranas construídas com novos materiais, como o óxido de alumínio (Al2O3), e também pelo uso de novas técnicas para a construção dos poros, não necessariamente proteícos. 

 

O método de fabricação de breakdown dielétrico, por exemplo, permite a formação de diversos poros ao mesmo tempo na membrana. O processo ocorre quando é aplicada uma alta voltagem em uma membrana construída em material isolante, até o ponto em que o material se torna condutor e permita a passagem de corrente elétrica. O breakdown ocorre quando o campo elétrico supera a força dielétrica do material  e como consequência ocorre a formação dos poros. 

 

Você já conhecia a tecnologia de sequenciamento por nanoporos? 

Ela é, sem dúvidas, revolucionária e tem um grande potencial. Por isso, deve ser cada vez mais utilizada!

 

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Saiba mais!

DNA nanotechnology assisted nanopore-based analysis

Introduction to nanopore sequencing

Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel

Solid-state nanopore sensors

 

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Última atualização: April 15, 2021, 3:59 p.m.

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