Construindo uma biblioteca de DNA

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Conheça melhor as metodologias de construção de biblioteca de DNA 

Autor | César H. Yokomizo

 

“O DNA é o manual de instruções dos seres vivos!”

 

Você já deve ter ouvido essa frase antes. Seria ótimo se conseguissemos armazenar o DNA como se fossem livros em bibliotecas, concorda? 

 

Pois saiba que isso não só é possível, como é feito recorrentemente. As bibliotecas de DNA são compostas por fragmentos de um ou mais genes de interesse, que servem como um repositório desse gene. 

 

Diagnósticos genéticos, estudos de metagenômica, são apenas alguns exemplos de situações onde a construção de bibliotecas de DNA são utilizadas. 

 

O workflow para a construção da biblioteca, após o passo inicial de isolar o DNA de interesse, segue algumas etapas fundamentais: 

 

1. Fragmentação do DNA;

2. Reparo de extremidades das fitas de DNA;

3. Adição de adaptadores aos fragmentos;

4. Adição de índices contidos nos adaptadores;  

5. Adição de primers também contidos nos adaptadores, e que são complementares à flow cell  do sequenciador.

 

Podemos imaginar os indices, que são pequenos pedaços nucleotideos, como as referências utilizadas para organizar os livros na biblioteca, cada indice irá indicar à qual fragmento ele está ligado. 

 

Os primers - pequena sequência de nucleotideos - são necessários para realizar o sequenciamento NGS, uma vez que eles são complementares a sequências que ficam imobilizadas na celúla de fluxo - flow cell - do equipamento sequenciador que realização o sequenciamento através da síntese - sequencing by synthesis - dos fragmentos.

 

Existem duas metodologias mais utilizadas na construção das bibliotecas : amplificação e hibridização. 

 

Na biblioteca por amplificação, o DNA isolado é fragmentado e tem suas extremidades reparadas, logo depois os fragmentos passam pela primeira etapa de amplificação, onde os primers utilizados irão adicionar os adaptadores, que por sua vez contém os indices e os primers complementares, permitindo que  os fragmentos sejam então sequenciados. 

 

Na etapa de amplificação em bibliotecas construídas através dessa metodologia, pode ocorrer o dropout - retirada - dos primers por não conseguirem se ligar em regiões com mutações, reduzindo assim a cobertura que se obtem da sequência a ser analisada. 

 

A biblioteca por hibridização também passa pela fragmentação, depois desse passo os adaptadores contendo os indices e os primers já são adicionados, dessa forma, não acontece o dropout de primers que pode ocorrer na bibliteca por amplificação. 

 

Depois disso ocorre a hibridização com uma sonda - biotina - que serve como uma “isca” para “pescar” os fragmentos de interesse que serão sequenciados.

 

Nas duas metodologias, os resultados do sequenciamento podem ser utilizados em pipelines de bioinformática para detecção de alterações genéticas através de alinhamento contra sequencias provenientes de bancos de dados genéticos. 

 

Uma vez que alguma alteração é encontrada, é possível por exemplo, traçar uma correlação dos resultados com patologias ou indicar tratamentos preventivos mais adequados a cada situação. 

 

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Saiba mais: 

 

Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges

 

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Última atualização: April 29, 2022, 4:32 p.m.

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